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没有氧气人活不了,细胞氧调节获得诺奖
作者:admin    发布于:2019-10-08 08:24    文字:【 】【 】【
        许多人知道一句话,“没有氧气人活不了,没有氢气人活不好”,今天关于氧气的研究获得了大奖,给这句话有增加了新的话题。其实关于氧气代谢的研究,历史上已经有过2次获得诺贝尔生理或医学奖了。
        第一次是氧气如何被细胞利用。第二次是身体如何感受到低氧,并通过神经反射对心肺功能进行调节。这次是第三次是细胞如何感受到氧气不足,并通过关键转录因子调节细胞内基因表达,这种反应也能影响到体内氧气的运输能力。
        氧气约占地球大气成分的21%,对动物生命至关重要,几乎所有动物细胞中的线粒体都会利用氧气,将有机物转化为能量。德国著名生理学家Otto Warburg 是 1931 年诺贝尔生理学或医学奖获得者,他揭示线粒体内存在细胞色素氧化酶,就是氧气被利用的酶。
        杰出的德国生物化学家瓦勃Otto Heinrich Warburg
        机体逐渐进化出确保向组织和细胞充分供氧的机制。颈动脉体与颈部两侧大血管相邻,包含专门感应血液中氧气水平的细胞。1938 年,Corneille Heymans 获得的诺贝尔生理学或医学奖,奖励他发现了颈动脉体和主动脉体感知血氧水平并通过神经中枢调节呼吸频率的作用。
        2019诺贝尔奖生理学或医学奖授予威廉·乔治·凯林(William G. Kaelin, Jr.)、彼得·约翰·拉特克利夫(Sir Peter J. Ratcliffe)、格雷格·伦纳德·塞门扎(Gregg. L. Semenza),以表彰三位在人及大多数动物细胞感知、适应氧气变化机制方面做出杰出的贡献。
        以下内容是2016年写的,主要就是介绍2019年获奖的背后故事,值得阅读。
        2016年9月22日,Thompson教授在《细胞》发表题为“Into Thin Air: How WeSense and Respond to Hypoxia”的评述文章,介绍了今年拉斯克奖基础医学研究奖关于“人与动物对氧气含量的细胞感知机制”。Gregg Semenza也写了关于低氧诱导因子发现的背后故事。本文根据这两个文献为主要参考,整理成本文,以让大家对这个故事有一个比较全面的了解。
        2016年拉斯克基础医学奖被William Kaelin、Peter Ratcliffe和Gregg Semenza三位分享,以奖励他们在发现动物细胞感受和适应氧气水平改变的分子机制,氧气感受信号系统在许多生理和病理过程中发挥关键作用。
        一、Semenza和低氧诱导因子
        中学生都知道,氧气对生命十分重要。每次呼吸,氧气被吸收进入血液,二氧化碳被释放到空气。氧气是能量代谢的关键成员,能量代谢是是4万亿细胞维持功能和生存的基础。细胞产生ATP有两个基本方式:需要氧气的氧化磷酸化和不需氧气的糖酵解。但是不需氧气的糖酵解产生ATP的效率非常低下,无法长时间维持,因此需要氧气的氧化磷酸化为细胞最基本的能量代谢模式。细胞一般利用葡萄糖作为能量代谢的原料,也能利用脂肪酸和氨基酸为原料。
        复杂的神经系统和肌肉运动需要大量的能量,如果ATP产生的效率不高,这些器官无法顺利完成正常功能。因此多细胞动物生命必然具有满足能量代谢需要的高效率利用氧气的能力。这也是研究细胞营养物质氧化产生ATP的过程能多次获得大奖的原因。但人们认识到大脑、心脏和肌肉主要依靠有氧代谢产生能量,关于氧气运输蛋白如血红蛋白和肌红蛋白的发现和特征的研究又成为获奖对象。虽然对需氧代谢和氧气运输的问题被逐渐解决,但关于氧气代谢的一个重要侧面,细胞感受和适应氧气的信号系统上世纪末才开始被逐渐弄清楚,这一信号系统会对环境缺氧和呼吸循环血液系统功能障碍产生显著改变。2016年的拉斯克基础医学奖正是给了三位发现动物细胞内氧气感受系统的科学家。
        WilliamKaelin、Peter Ratcliffe和 Gregg Semenza是独立开展研究的科学家,但是他们的工作是关于细胞感受氧气的一个整体系统。该发现的源头是关于一个蛋白的研究,这种蛋白是促红细胞生成素(Erythropoietin促红素),肝脏和肾脏细胞合成的促红素作用是一种激素,基本功能是促进骨髓内红细胞生成,这样可以提高血液运输氧气的能力。
        Semenza对这个基因研究一段时间后,兴趣逐渐转移到这个基因表达的调节机制,这一兴趣转移打开了这个领域的一扇窗口。利用转基因小鼠,1992年他和学生王广良在肝脏细胞的促红素基因的3’端增强子区发现一段低氧反应元件,这暗示存在一种转录因子能结合这个区域促进促红素基因表达。经过反复探索,1995年他们纯化到这种转录因子,这是一种二聚体蛋白,因为在低氧条件下发挥转录促红素基因的作用,被命名为低氧诱导因子。
        最近Semenza对转录因子发现过程的回顾,他说杜克大学医学院毕业前,他对医学遗传学产生了兴趣,1986年来到现代医学遗传学之父维克多工作过的霍普金斯深造,当时他投奔的老师是海哥和史泰龙。
        那个时代转基因小鼠刚刚兴起,根据两个导师的兴趣, Semenza 准备研究凝血因子8基因。正好那时遗传所强克博士克隆了因子8基因,Semenza去找强克帮忙要一些基因组克隆。不过强克建议他考虑研究另一个已经被他克隆好的促红素基因(是瞎猫?)。
        促红素是血液激素,胚胎期在肝脏产生,成年后转移到肾脏。血液中的促红素能作用在骨髓中的红细胞祖细胞,刺激这种细胞产生更多红细胞。尿毒症患者肾脏合成促红素的能力下降会发生严重贫血,只能通过输血治疗。可以用基因工程技术用促红素基因人工合成促红素,治疗尿毒症贫血显然是一味良药。Semenza开始兴趣是希望弄清楚,为什么胎儿时期在肝脏表达的促红素成年后怎么转移到肾脏?他推测这个基因存在多个不同的增强子,这样在不同生理条件下,条件这个基因在不同部位表达。但是这个基因显然还受到低氧因素的调节,这对研究这个基因带来很大挑战。刚涉足科研的青年人Semenza不懂转基因技术。在生理系约翰教授帮助下,Semenza建立了促红素转基因小鼠。这个小鼠的表现符合预期,能让动物产生更多红细胞,也说明这个转基因是成功的。通过设计具有不同DNA长度片段的转基因小鼠,他们验证了最初的想法。就是促红素在肝脏和肾脏等不同组织的差异表达主要受到该基因3’和  5’区域调控。
        回答了为什么胚胎和成年时期促红素在不同器官表达的疑问后。Semenza下一步的目的就是试图回答该基因生理调控的机制。利用哈罗德建立的核酸酶敏感分析实验,寻找调控促红素表达的瞬式作用元件,Semenza将人源促红素转基因小鼠肝脏细胞核提取出来,发现人源促红素基因超敏点在于3’端。这一段序列正好囊括了低氧反应元件,即一段对低氧非常敏感的基因转录活性序列。
        Semenza等猜想,存在一种和低氧反应元件互补的成分能激活促红素基因表达。可以说这个时候他们发现了一种工具,然后利用这个工具找到了一种神奇的分子。随后进行了一系列的“电泳迁移”实验,就是把包含低氧反应元件的DNA双链进行同位素标记,寻找能结合这个低氧反应元件的目标蛋白。实验的关键是需要小心去除非特异性结合蛋白,否则可能是错误的目标。
        这时Semenza晋升为课题组长,招收了第一个博士后王广良。王广良博士每天都重复凝胶迁移实验,尝试不同的盐浓度和DNA片段。开始数周都是阴性结果,无法区分低氧条件和对照组之间的差异。数周后的一天,Semenza看到非常美丽的凝胶迁移胶片。Semenza对着荧光灯,一个接一个的仔细检查,努力寻找低氧和对照组之间的区别,直到我发现有一条条带发生略微迁移。他们终于找到了梦寐以求的那个隐藏在众多分子之间被低氧诱导出的蛋白条带。王光立刻开始了新一轮重复实验,通过优化条件,一周内就获得了更加令人信服的一条清晰的条带。这就是Semenza等一直苦苦寻找的具有DNA结合活性的低氧诱导因子-1。
        接着鉴定这一蛋白质特性,他们再次遇到挫折。恰好附近的卡内基研究所史蒂夫开发了一种技术,通过利用重组噬菌体表达哺乳动物cDNA结合放射性寡核苷酸筛选技术,检测能够与探针相结合的蛋白质。与史蒂夫合作筛选了成千上万的噬菌体,但一无所获。没有办法只能退回到经典办法,把这个目标蛋白质纯化出来。但是这种技术对Semenza来说完全陌生,而且实验条件也不完善,这几乎是难以完成的任务。
        Semenza当时获得了马克慈善基金会资助,每年所有基金获得者都会聚在一起开个年会。那一年,乔做了一个令人印象深刻的晚宴致辞,他强调在追寻问题答案时,需要一种“技术上的勇气”,即便这些技术不是自己所擅长的,这些话给了Semenza很大的鼓舞。另外他幸运地认识了霍普金斯分子生物学与遗传学系的汤姆,他是第一个成功纯化DNA相结合蛋白质的分子生物学家。在汤姆的帮助和技术支持下,对野生型和突变型细胞核提取物进行DNA亲和层析实验,初步实验数据表明有两个多肽共同与我们的靶向DNA序列相结合,分别称为低氧诱导因子1α和β。这种异二聚体蛋白,采用噬菌体表达单个多肽的筛选法,显然是南辕北辙。因为必须是两个蛋白一起才能结合目标DNA序列,一个分子再多也没有用,所以说选择合适的技术有时候对科研是非常关键的。
        这时他们已经发现所有哺乳动物细胞都可以找到低氧诱导因子1蛋白,通过扩大纯化规模,获得了足够量的低氧诱导因子1α和β,在维斯塔研究所大卫实验室帮助下,对这些蛋白进行了序列分析。1995年,他们获得这个蛋白的序列,然后发现其中β就是奥利弗发现并被命名为芳香烃受体核转运子ARNT。不过低氧诱导因子1α没有在过去的基因库中发现类似的结构,随后他们用低氧细胞cDNA文库成功克隆了低氧诱导因子1α的cDNA。这种蛋白的发现和cDNA序列的克隆,极大地推动了低氧诱导因子的功能研究,随后世界各地学者先后在发育生物学、生理学、医学以及进化学等方面分别取得了进展。
        二、从低氧诱导因子到低氧感受器
        刚开始发现低氧诱导因子1时,Semenza并没有完全意识到这个蛋白功能的重要性,而是推测这个蛋白可能不仅仅调节促红素基因表达。1996年发表了一个关键发现,是他们证明低氧诱导因子1也能诱导血管内皮细胞生成因子基因表达,这是负责血管生成的分子。血管生成和红细胞生成代表两个低氧反应的重要类型,这说明低氧诱导因子1是细胞感受低氧的中心分子。为了确认低氧诱导因子1在这些器官中的作用过程,Semenza制备了低氧诱导因子1基因敲除小鼠。1998年发表的结果发现,这种动物存在血管发育和氧依赖基因表达的严重缺陷,在子宫内就发生死亡。
        在Semenza发现基础上,Peter Ratcliffe对低氧诱导因子进行了更深入研究。长期以来,科学家一直认为氧气的感受只是少数细胞特有的能力。例如在颈动脉体和主动脉体就存在感受血液中氧气浓度的化学感受器,能通过神经反射调节呼吸频率和血压。但是Ratcliffe等1993年的研究发现,许多细胞内低氧反应元件DNA结合活性受到氧浓度调节,说明低氧诱导因子是许多细胞感受低氧的共同分子。1994年Ratcliffe进一步用糖酵解酶也受到低氧反应元件调节确定了这一判断。糖酵解也是细胞对低氧的一类反应,但和血管生成和红细胞生成属于长期低氧效应不同,糖酵解属于快速低氧反应。这说明低氧诱导因子不仅负责调节长期低氧反应,也是急性低氧反应的调节因子。
        三、从临床疾病出发
        不同于Semenza和Ratcliffe,Kaelin教授是研究癌症的临床医生。在临床实习阶段,Kaelin就知道某些肾脏肿瘤能促进血管形成,这些肿瘤细胞失去一种抑癌基因VHL,VHL最早是在von Hippel-Lin- dau综合征患者被确定的,因        此命名为VHL。但是克隆VHL并没有提供任何分子功能的帮助。1995年,Kaelin小组发现VHL蛋白能与延伸因子B、延伸因子C和CUL2形成复合物。因为延伸因子C和CUL2和酵母蛋白SKP1和Cdc53同源,提示VHL蛋白/延伸因子/CUL2复合物可能是一种泛素链接酶。泛素链接酶与肾脏肿瘤血管增生怎么有关系?Kaelin推测VHL缺乏可能会让细胞产生更多内皮细胞生长因子,后者是造成血管大量产生的原因。不过他却发现,VHL缺陷能导致低氧诱导因子调控基因表达上调,这些基因刚刚被Ratcliffe和 Semenza发现,其中包括内皮细胞生长因子基因。
        四、确定氧气感受器
        既然泛素链接酶活性下降也能激活低氧诱导因子,那么低氧诱导因子可能受到泛素链接酶的调节。Ratcliffe和Kaelin都想到一种简单漂亮的翻译后调节模式。
        PeterRatcliffe回忆自己开展氧感受研究的过程,是从上个世纪80年代开始。临床上低血压患者经常发生肾损伤,作为肾内科医生,Ratcliffe希望深入理解休克为什么更容易造成肾脏损伤。从这种研究中,他对在低氧分压而不是血流量降低导致肾脏促红细胞生成素合成增加的现象产生了兴趣。人们认为这可能与肾脏不同寻常的循环有关,特殊循环导致肾中心组织氧张力非常低,但他经过研究并没有确定这种关系。他考虑的另外一个角度是研究氧感受过程,认为肾脏在氧气感受方面具有独特性是肾脏对缺氧更敏感的原因。从此以后他就一直关注氧感受的问题。
        Kaelin最近回忆自己如何从事氧感受研究。当他在约翰霍普金斯医院的住院总医生时,比较偏爱研究一种罕见病VHL综合征,因为这这能提高他在学生们面前的权威性,可以提问实习生这个疾病的有关问题。临床医生倾向于记住各种症状,以及造成这些症状的可能原因。但VHL基因被克隆时,他早就知道某些肾癌与该基因有关,也知道那些肿瘤有非常丰富的血管,患者体内偶尔产生过多红细胞。。因此认为研究VHL将能有助于理解这种肾癌,也可帮助理解血管生成的道理。因为血管生成和红细胞生成的共同点都可由缺氧诱导。Kaelin认为,VHL病好像让身体不断误以为缺氧并发出求救信号,这种信号通常是真正缺氧的信号。弄清楚这个道理,可以帮助人们理解氧的感受方式。
        他们首先证明,VHL能发挥E3泛素链接酶作用,将低氧诱导因子1α泛素化,一旦低氧诱导因子1α泛素化就会发生降解。在2001年的背靠背论文中,Ratcliffe和Kaelin分别报道,存在氧气的条件下,低氧诱导因子1α发生脯氨酸羟化,脯氨酸羟化是低氧诱导因子1α和VHL结合并泛素化降解的条件。接下来的问题是,低氧诱导因子1α脯氨酸羟化是如何实现的。Ratcliffe、Kaelin和Steve McKnight三家实验室独立报道了这种脯氨酸羟化酶。另外一个调节低氧诱导因子1α转录活性的是天冬氨酸羟化酶,天冬氨酸羟化能阻断低氧诱导因子1α招募转录共激活因子。这两个羟化酶都需要氧气作为反应底物,氧气存在时,脯氨酸羟化,低氧诱导因子1α被降解,天冬氨酸羟化低氧诱导因子1α活性下降;缺氧时羟化酶失去活性,促进降解和抑制活性的过程都被抑制,结果是低氧诱导因子1α水平增加活性增强。这样就彻底找到氧气的感受器脯氨酸羟化酶和天冬氨酸羟化酶。
        五、羟化酶也能感受氧化应激
        低氧诱导因子1α羟化酶能感受氧气水平,其实这种酶的底物不仅只有氧气,还有铁离子、维生素C、α酮戊二酸等,氧气水平影响这种酶活性,其他代谢物质也可能同样有这种作用,那么这种酶也许是这些代谢物感受器。在这种酶刚被确认为氧气感受器后不久,就有研究证明其他一些代谢物也能调节这种酶活性,羟化酶包括活性中心的铁离子,反应底物是氧气和α酮戊二酸,反应产物是琥珀酸和二氧化碳。
        低氧情况下持续抑制羟化酶活性部分是因为乳酸脱氢酶将α酮戊二酸转化为L2羟基戊二酸,结构类似的L2羟基戊二酸能竞争抑制α酮戊二酸和羟化酶的结合发挥抑制作用。这些发现符合某些人类肿瘤血管大量增加的表现,这些肿瘤细胞的琥珀酸脱氢酶或延胡索酸酶基因突变导致功能丧失,这导致常氧条件下低氧诱导因子1α水平增加。这些酶缺乏,会造成三羧酸循环代谢物琥珀酸或延胡索酸积累,这些代谢物可抑制羟化酶活性,产生类似低氧的效应。
        低氧诱导因子1脯氨酸羟化酶也具有氧化还原感受作用,铁离子和半胱氨酸是低氧诱导因子1三维结构维持功能的关键因素,都会受到细胞线粒体氧化还原状态影响。氧化还原敏感性使脯氨酸羟化酶不仅是低氧耐受的关键,也是能量代谢和氧化平衡的关键。在这种情况下,低氧诱导因子1诱导丙酮酸脱氢酶激酶的表达,抑制三羧酸循环,同时诱导乳酸脱氢酶A使丙酮酸转化为乳酸释放到细胞外(浙大小苏打抗癌的理论基础)。因此,低氧诱导因子1不仅使细胞耐受低氧,也能使细胞耐受营养过剩,使细胞从需氧的氧化磷酸化转变为糖酵解代谢模式发挥抗氧化应激作用。
        六、羟化酶是代谢状态感受器
        低氧诱导因子1脯氨酸羟化酶活性在氧浓度生理效应调节重要作用的发现,让人们对氧气的其他细胞功能调节产生了兴趣。许多氧分子依赖的酶被推测也具有低氧感受和调节能力,例如DNA胞嘧啶甲基羟化酶TET和含有Jumonji C结构域的组蛋白去甲基化酶都类似于脯氨酸羟化酶。这些催化DNA和蛋白甲基化的羟化酶和脯氨酸羟化酶一样,都需要α酮戊二酸和氧分子为底物完成羟基化和脱羧基催化反应。因为这些酶催化的反应细胞表观遗传学的重要调节方式,对染色体结构会产生影响,这些发现能解释为什么大多数成年哺乳动物组织内干细胞总是分布在相对低氧的巢内。异柠檬酸脱氢酶1或2发生突变,会导致这些依赖α酮戊二酸的双加氧酶功能下降,影响组蛋白和DNA甲基化作用,并导致组织癌变。异柠檬酸脱氢酶突变可引起合成羟基戊二酸的酶活性代偿性提高,羟基戊二酸能与α酮戊二酸竞争与羟化酶的结合,导致组蛋白和DNA甲基化作用被抑制。
        这些结果提示,依赖α酮戊二酸的双加氧酶不仅是多细胞生物用于感受低氧的关键分子,也是在营养状态不良或缺氧情况下调节胚胎发育和分化的关键分子。
 
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